PCR — Polymerase Chain Reactione

O PCR (Reação em cadeia da polimerase) permite a replicação dos genes, isto é, a obtenção in vitrio de milhões de cópias idênticas de uma certa região do DNA, a partir de uma região de DNA molde. Para tal, é necessária a utilização da Taq polimerase, uma DNApolimerase termoestável proveniente de uma bactéria termofílica (Thermus aquaticus, que vive a uma temperatura ótima de 70ºC). Esta enzima termoestável é fundamental, uma vez que as DNApolimerases do ser humano não funcionam a altas temperaturas, necessárias para a desnaturação e quebra da dupla hélice de DNA. 

Esta técnica muito útil para análises genética, como na ciência forense. 

O procedimento do PCR baseia-se num ciclo com 3 temperaturas diferentes para separar as cadeias de DNA e duplicar o material genético:

1. Extrai-se o segmento de DNA da amostra.
2. Eleva-se a temperatura a 90ºC, para separar completamente a cadeia dupla de DNA em duas cadeias simples;
3. Reduz-se a temperatura para os 55ºC , de forma a que os primers (fragmentos curtos de DNA sintético) se liguem ao seu DNA complementar (que corresponde à região do DNA-amostra que se pretende replicar.) 
4. Eleva-se a temperatura até aos 72ºC para que a Taq polimerase comece a adicionar nucleótidos ao fragmento de DNA (primer) pré-existente, até ser restabelecida a cadeia dupla.

Este ciclo (etapa 2, 3 e 4) repete-se 25 a 30 vezes e demora cerca de 2 a 3 horas, dependendo do tamanho do fragmento de DNA a replicar. No final da técnica, têm-se milhões de cópias do fragmento. Na teoria, o DNA aumentaria 2²⁵ vezes. Todavia, na prática a amplificação não é tão eficiente, resultando num aumento de 1 milhão de vezes.

Normalmente, o resultado do PCR é confirmado pela eletroforese em gel, onde os fragmentos de DNA irão migrar do pólo negativo para o pólo positivo (uma vez que o DNA é rico em cargas negativas, devido aos grupos fosfato), sendo separados consoante o seu tamanho molecular. Quanto menor for o fragmento, mais célere será a sua migração. Fragmentos de DNA com o mesmo comprimento (por exemplo, 2 fragmentos com 300 pares de bases) migrarão a mesma distância no gel. 

Desta forma, através de um DNA ladder (cujos fragmentos de DNA são de tamanho conhecido) é possível determinar de que tamanho é o fragmento de DNA em estudo. Claro que, sendo o DNA microscópico, apenas a existência de muitos fragmentos idênticos será visível (daí ser necessário o PCR):

Para além da eletroforese em gel, o produto de PCR pode ainda ser utilizado para a sequenciação, testes genéticos, diagnósticos, entre outros.

Exercício: Com base no resultado da eletroforese da mãe e do pai, qual destas crianças é o filho do casal?

Para ver a resposta, sublinhar com o rato o espaço seguinte: A criança 1, uma vez que só ela tem as mesmas bandas que o pai e a mãe. As crianças 1 e 3 não são filhas do casal, pois têm bandas que não existem na eletroforese da mãe e do pai.

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Alguns Marcos Históricos da Genética

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Alguns Marcos Históricos da Genética

A genética é uma das áreas mais proeminentes da microbiologia. Embora seja uma área relativamente recente, já se realizam melhoramentos genéticos há milhares de anos, empírico é claro, que vieram a determinar a nossa alimentação.

1651 — William Harvey afirma que todas as coisas vivas têm origem em ovos.

1665 — Robert Hooke descobre a célula, a partir de cortiça.

1674 — Anton van Leeuwenhoek desenvolve a microscopia ótica.

1735 — Carl Linnaeus estabelece o sistema binomial (Homo Sapiens, género espécie), que permitiu a formação de árvores genealógicas. Ainda não havia DNA, pelo que se comparou os seres vivos e daí se formularam os nomes.

1809 — Jean-Baptiste de Lamarck propôs o conceito de evolução, isto é, que não existimos como fomos criados, mas somos o resultado de uma evolução biológica (transmissão de características adquiridas). É daqui que se retira o conceito da girafa ter esticado o pescoço até este ficar comprido, passando-o à descendência.

1833 — Robert Brown descobre o núcleo celular das células eucariotas.

1835/39 — Hugo von Mohl descreve o protoplasma e propõe a mitose (processo de divisão celular).

1858 — Rudolf Virchow demonstra a Teoria Celular.

1859 — Charles Darwin afirma sermos descendentes de outros primatas e ainda propõe o conceito de seleção natural.

1865 — Gregor Mendel, considerado o pai da genética, é o primeiro a estabelecer as leis da hereditariedade. Sucintamente, utiliza num ser vivo de fácil e rápida reprodução em grandes quantidades, a ervilheira, para observar as gerações vindouras, relacionando a genética com uma análise estatística. 

1875 — Francis Galton demonstra a utilidade do estudo de gémeos.

1875 — Oscar Hertwig prova a fusão entre o espermatozóide e o óvulo.

1879 — Wealther Fleming estuda os cromossomas e os processos que os envolvem.

1887 — Hertwig-Boveri foram os pioneiros no estudo da meiose.

1903 — Walter Sutton estuda a meiose, os cromossomas e a teoria Mendeliana.

1913 — Alfred Sturtevant retrata o 1º mapa genético de um cromossoma.

1927 — Stadler-Muller explicam a mutação provocada pelo raio-X.

1943 — Fisher-Wright-Haldane abordam o processo de evolução.

1944/52 — Avery-Chase denominam DNA como material genético.

1949 — Linus Pauling é o responsável pela genética molecular, ou seja, pela capacidade de avaliar a nível molecular. Demonstrou que uma alteração na estrutura da hemoglobina leva à anemia falciforme.

1953 — JD Watson e F Crick propõem a estrutura molecular do DNA.

1972 — Paul Berg obtém a 1ª molécula recombinante (como a bactéria com o gene para sintetizar insulina humana).

1982 — Frederick Sanger inicia a era da sequenciação dos genomas (AGTAGC…).

1983 —Localizado o gene da coreia de Huntington, que resulta no surgimento do termo “mutações genéticas”.

1986 — Com a técnica de PCR (Polymerase Chain Reactione), surge a possibilidade de produzir grande número de cópias de DNA in vitrio.

1998 — Sequencia-se o genoma completo de uma ser vivo, o Caenorhabditis elegans.

2003 — sequenciação de 99% do genoma humano.

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